Děkujeme za návštěvu www.chinacdoe.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Systémy Lab-on-a-chip s možnostmi na místě nabízejí potenciál pro rychlou a přesnou diagnostiku a jsou užitečné v prostředí s omezenými zdroji, kde není k dispozici biomedicínské vybavení a vyškolení odborníci.Hlavním úkolem však zůstává vytvoření testovacího systému v místě péče, který má současně všechny nezbytné funkce pro multifunkční dávkování, uvolňování na vyžádání, spolehlivý výkon a dlouhodobé skladování reagencií.Zde popisujeme technologii mikropojezdového spínače ovládaného pákou, která dokáže manipulovat s tekutinami v libovolném směru, poskytuje přesnou a proporcionální odezvu na aplikovaný tlak vzduchu a zůstává stabilní vůči náhlým pohybům a vibracím.Na základě této technologie také popisujeme vývoj systému polymerázové řetězové reakce, který integruje funkce zavádění reagencií, míchání a reakční funkce v jednom procesu, který zajišťuje výkon „vzorek-do-odpověď-out“ pro všechny klinické vzorky nosu od 18 pacientů s Chřipka a 18 jednotlivých kontrol, v dobré shodě intenzity fluorescence se standardní polymerázovou řetězovou reakcí (Pearsonovy koeficienty > 0,9).Na základě této technologie také popisujeme vývoj systému polymerázové řetězové reakce, který integruje funkce zavádění reagencií, míchání a reakční funkce v jednom procesu, který zajišťuje výkon „vzorek-do-odpověď-out“ pro všechny klinické vzorky nosu od 18 pacientů. s chřipkou a 18 jednotlivými kontrolami, v dobré shodě intenzity fluorescence se standardní polymerázovou řetězovou reakcí (Pearsonovy koeficienty > 0,9).Основываясь на этой технологráž, мы также описываем разраба р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р с с р с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с р с р с р с с р с с р р р р р р р р р р р р с с р р р с р р р р р р р р р р р р р р р р ии ведения реагентов, смешивания „ и 18 отдельных контролей, в хорошем соответствии интенсивности флуоресценций со сортенонз епной реакцией (коэффициенты Пирсона> 0,9).Na základě této technologie také popisujeme vývoj systému polymerázové řetězové reakce, který kombinuje funkce injekce, míchání a reakce v jediném procesu, což umožňuje odběr vzorku v reakci pro všechny klinické vzorky nosu od 18 pacientů s chřipkou.a 18 jednotlivých kontrol, v dobré shodě se standardní intenzitou fluorescence polymerázové řetězové reakce (Pearsonovy koeficienty > 0,9).Na základě této technologie také popisujeme vývoj systému polymerázové řetězové reakce, který integruje vstřikování činidel, míchání a reakční funkce pro analýzu všech klinických nosních vzorků z 18 vzorků nosních pacientů ve vzorku. Chřipka a 18 jednotlivých kontrol, intenzita fluorescence se shoduje jamka se standardní polymerázovou řetězovou reakcí (Pearsonův koeficient > 0,9).Navržená platforma zaručuje spolehlivou automatizaci biomedicínské analýzy a může tak urychlit komercializaci řady testovacích zařízení v místě péče.
Vznikající lidské nemoci, jako je pandemie COVID-19 v roce 2020, která si vyžádala životy milionů lidí, představují vážnou hrozbu pro globální zdraví a lidskou civilizaci1.Včasná, rychlá a přesná detekce nemocí je zásadní pro kontrolu šíření viru a zlepšení výsledků léčby.Základní diagnostický ekosystém založený na centralizovaných laboratořích, kde jsou testovací vzorky zasílány do nemocnic nebo diagnostických klinik a provozovány profesionály, v současnosti omezuje přístup pro téměř 5,8 miliardy lidí na celém světě, zejména pro ty, kteří žijí v prostředí s omezenými zdroji.kde chybí drahé biomedicínské vybavení a kvalifikovaní specialisté.lékaři 2. Existuje tedy naléhavá potřeba vyvinout levný a uživatelsky přívětivý laboratorní systém na čipu se schopností testování v místě péče (POCT), který může lékařům poskytnout včasné diagnostické informace, aby mohli přijímat informovaná rozhodnutí o diagnóze .a léčba 3.
Směrnice Světové zdravotnické organizace (WHO) uvádějí, že ideální POCT by měl být cenově dostupný, uživatelsky přívětivý (snadno použitelný s minimálním zaškolením), přesný (vyhněte se falešným negativům nebo falešným pozitivním výsledkům), rychlý a spolehlivý (poskytuje dobré vlastnosti opakovatelnosti) a dosažitelné (schopné dlouhodobého skladování a snadno dostupné koncovým uživatelům)4.Aby byly splněny tyto požadavky, musí systémy POCT poskytovat následující funkce: všestranné dávkování pro snížení manuálních zásahů, uvolňování na vyžádání do přepravy reagencií pro přesné výsledky testů a spolehlivý výkon, aby odolal okolním vibracím.V současnosti je nejrozšířenějším POCT zařízením laterální průtokový pás5,6 sestávající z několika vrstev porézních nitrocelulózových membrán, které tlačí velmi malé množství vzorku dopředu a reagují s předem imobilizovanými reagenciemi kapilární silou.Přestože mají výhodu nízké ceny, snadného použití a rychlých výsledků, lze zařízení POCT na bázi průtokových proužků použít pouze pro biologické testy (např. glukózové testy7,8 a těhotenské testy9,10) bez nutnosti vícestupňových analýz.reakce (např. plnění více činidel, míchání, multiplexování).Kromě toho hnací síly, které řídí pohyb tekutiny (tj. kapilární síly), neposkytují dobrou konzistenci, zejména mezi dávkami, což má za následek špatnou reprodukovatelnost11 a boční pásy toku jsou primárně užitečné pro dobrou detekci12,13.
Rozšířené výrobní možnosti v mikro- a nanoměřítku vytvořily příležitosti pro vývoj mikrofluidních POCT zařízení pro kvantitativní měření14,15,16,17.Nastavením vlastností rozhraní 18, 19 a geometrie kanálků 20, 21, 22 lze řídit kapilární sílu a průtok těchto zařízení.Jejich spolehlivost, zejména u vysoce smáčených kapalin, však zůstává nepřijatelná kvůli výrobním nepřesnostem, materiálovým vadám a citlivosti na vibrace prostředí.Navíc, protože kapilární tok je vytvořen na rozhraní kapalina-plyn, nemůže být zaveden žádný další tok, zejména po naplnění mikrofluidního kanálu kapalinou.Pro složitější detekci je proto nutné provést několik kroků nástřiku vzorku24,25.
Mezi mikrofluidními zařízeními jsou v současnosti jedním z nejlepších řešení pro POCT26,27 odstředivá mikrofluidní zařízení.Jeho hnací mechanismus je výhodný v tom, že hnací sílu lze ovládat nastavením rychlosti otáčení.Nevýhodou však je, že odstředivá síla je vždy směrována k vnějšímu okraji zařízení, což ztěžuje realizaci vícestupňových reakcí potřebných pro složitější analýzy.Ačkoli jsou pro multifunkční dávkování kromě odstředivé síly zavedeny další hnací síly (např. kapiláry 28, 29 a mnoho dalších 30, 31, 32, 33, 34, 35), může stále dojít k nepředvídanému přenosu kapaliny, protože tyto dodatečné síly jsou obecně řády o velikosti nižší než odstředivá síla, takže jsou účinné pouze v malých provozních rozsazích nebo nejsou dostupné na vyžádání s uvolňováním kapaliny.Začlenění pneumatických manipulací do odstředivých mikrofluidií, jako jsou odstředivé kinetické metody 36, 37, 38, termopneumatické metody 39 a aktivní pneumatické metody 40, se ukázalo jako atraktivní alternativa.Při kontrafugodynamickém přístupu je do zařízení integrována další dutina a spojovací mikrokanály pro vnější i vnitřní působení, ačkoli jeho účinnost čerpání (v rozsahu od 75 % do 90 %) je vysoce závislá na počtu čerpacích cyklů a viskozitě. kapaliny.V termopneumatické metodě jsou latexová membrána a komora pro přenos tekutiny speciálně navrženy tak, aby utěsnily nebo znovu otevřely vstup, když je zachycený objem vzduchu ohříván nebo ochlazen.Nastavení ohřevu/chlazení však přináší problémy s pomalou odezvou a omezuje jeho použití v termosenzitivních testech (např. amplifikace polymerázové řetězové reakce (PCR).S aktivním pneumatickým přístupem se uvolnění na vyžádání a pohyb dovnitř dosáhne pomocí současné aplikace přetlaku a přesně přizpůsobených rychlostí otáčení vysokorychlostními motory.Existují i další úspěšné přístupy využívající pouze pneumatické pohony (přetlak 41, 42 nebo podtlak 43) a konstrukce ventilů s normálně uzavřenými ventily.Postupným působením tlaku v pneumatické komoře je kapalina čerpána peristalticky dopředu a normálně uzavřený ventil zabraňuje zpětnému toku kapaliny v důsledku peristaltiky, čímž se realizují složité kapalinové operace.V současné době však existuje pouze omezený počet mikrofluidních technologií, které mohou provádět složité operace s kapalinami v jediném zařízení POCT, včetně multifunkčního dávkování, uvolňování na vyžádání, spolehlivého výkonu, dlouhodobého skladování, manipulace s kapalinami s vysokou viskozitou, a nákladově efektivní výrobu.Vše ve stejnou dobu.Absence vícestupňové funkční operace může být také jedním z důvodů, proč bylo dosud na otevřený trh úspěšně uvedeno jen několik komerčních produktů POCT, jako jsou Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat a Rhonda.
V tomto článku navrhujeme pneumatický mikrofluidní pohon založený na technologii mikrospínačů se zeleným prstencem (FAST).FAST kombinuje všechny potřebné vlastnosti současně pro širokou škálu činidel od mikrolitrů po mililitry.FAST se skládá z elastických membrán, pák a bloků.Bez použití tlaku vzduchu mohou být membrány, páky a bloky těsně uzavřeny a kapalina uvnitř může být uložena po dlouhou dobu.Když je aplikován vhodný tlak a nastaven na délku páky, membrána se roztáhne a zatlačí páku do otevřené polohy, čímž umožní průchod kapaliny.To umožňuje multifunkční dávkování kapalin kaskádovým, simultánním, sekvenčním nebo selektivním způsobem.
Vyvinuli jsme systém PCR využívající FAST ke generování výsledků odezvy ve vzorku pro detekci virů chřipky A a B (IAV a IBV).Dosáhli jsme spodního limitu detekce (LOD) 102 kopií/ml, náš multiplexní test ukázal specificitu pro IAV a IBV a umožnil patotypizaci viru chřipky.Výsledky klinického testování s použitím vzorku nosního výtěru od 18 pacientů a 18 zdravých jedinců vykazují dobrou shodu intenzity fluorescence se standardní RT-PCR (Pearsonovy koeficienty > 0,9).Výsledky klinického testování s použitím vzorku nosního výtěru od 18 pacientů a 18 zdravých jedinců vykazují dobrou shodu intenzity fluorescence se standardní RT-PCR (Pearsonovy koeficienty > 0,9).Результаты клинических испытаний с использованием образца мазка из носа от 18. ревпп лиц показывают хорошее соответствие интенсивности флуоресценции стандартшее соответствие > 0,9).Výsledky klinických studií s použitím vzorku nosního výtěru od 18 pacientů a 18 zdravých jedinců ukazují dobrou shodu mezi intenzitou fluorescence standardní RT-PCR (Pearsonovy koeficienty > 0,9).0,9）.............. Результаты клин </s> и с с и л с с о и и л с с с л с с с с с с с с с с с с с с тветствие межж и иэ оэ о от -esцр и ооээвностюю ф už.Výsledky klinických studií s použitím vzorků z nosních výtěrů od 18 pacientů a 18 zdravých jedinců prokázaly dobrou shodu mezi intenzitou fluorescence a standardní RT-PCR (Pearsonův koeficient > 0,9).Odhadované náklady na materiál zařízení FAST-POCT jsou přibližně 1 USD (doplňková tabulka 1) a lze je dále snížit použitím výrobních metod ve velkém měřítku (např. vstřikování).Zařízení POCT založená na FAST mají ve skutečnosti všechny nezbytné funkce nařízené WHO a jsou kompatibilní s novými biochemickými testovacími metodami, jako je plazmatická termální cyklizace44, imunoanalýzy bez amplifikace45 a testy funkcionalizace nanobody46, které jsou páteří systémů POCT.možnost.
Na Obr.la ukazuje strukturu platformy FAST-POCT, která se skládá ze čtyř kapalinových komor: předskladovací komory, směšovací komory, reakční komory a odpadní komory.Klíčem k řízení průtoku tekutiny je konstrukce FAST (skládající se z elastických membrán, pák a bloků) umístěná v předskladovací komoře a směšovací komoře.Jako pneumaticky ovládaná metoda poskytuje konstrukce FAST přesné řízení průtoku kapaliny, včetně přepínání zavřeno/otevřeno, všestranné dávkování, uvolňování kapaliny na vyžádání, spolehlivý provoz (např. necitlivost na vibrace prostředí) a dlouhodobé skladování.Platforma FAST-POCT se skládá ze čtyř vrstev: zadní vrstva, vrstva elastického filmu, vrstva plastového filmu a krycí vrstva, jak je znázorněno ve zvětšeném pohledu na obr. 1b (také podrobně zobrazeno na doplňkových obrázcích S1 a S2 ).Všechny kanály a komory pro přenos tekutiny (jako jsou předskladovací a reakční komory) jsou zapuštěny do substrátů PLA (kyselina polymléčná) o tloušťce od 0,2 mm (nejtenčí část) do 5 mm.Elastický filmový materiál je 300 µm tlustý PDMS, který se snadno roztahuje při působení tlaku vzduchu díky své „tenké tloušťce“ a nízkému modulu pružnosti (asi 2,25 MPa47).Polyetylenová fóliová vrstva je vyrobena z polyethylentereftalátu (PET) o tloušťce 100 µm pro ochranu elastické fólie před nadměrnou deformací vlivem tlaku vzduchu.Vrstva substrátu má odpovídající komůrkám páky spojené s krycí vrstvou (vyrobenou z PLA) pomocí pantů pro ovládání průtoku kapaliny.Elastická fólie byla přilepena k podkladové vrstvě pomocí oboustranné lepicí pásky (ARseal 90880) a překryta plastovou fólií.Tři vrstvy byly sestaveny na substrát pomocí designu T-spony v krycí vrstvě.T-svorka má mezeru mezi dvěma nohami.Když byla spona vložena do drážky, dvě nohy se mírně ohnuly, pak se vrátily do původního stavu a těsně svázaly víko a podložku, když prošly drážkou (doplňkový obr. S1).Čtyři vrstvy se pak spojí pomocí spojek.
Schematický diagram platformy znázorňující různé funkční oddíly a vlastnosti FAST.b Zvětšené schéma platformy FAST-POCT.c Fotografie plošiny vedle mince za čtvrt dolaru.
Pracovní mechanismus platformy FAST-POCT je znázorněn na obrázku 2. Klíčovými součástmi jsou bloky na základní vrstvě a panty na krycí vrstvě, což má za následek interferenční design, když jsou čtyři vrstvy sestaveny pomocí tvaru T .Když není aplikován žádný tlak vzduchu (obr. 2a), interferenční uložení způsobí, že se závěs ohne a deformuje, a prostřednictvím páky je aplikována těsnící síla, která přitlačí elastickou fólii proti bloku a kapalina v dutině těsnění je definována jako zapečetěný stav.Je třeba poznamenat, že v tomto stavu je páka ohnutá směrem ven, jak je znázorněno v bočním pohledu na obr. 2a.Při přívodu vzduchu (obr. 2b) se elastická membrána roztahuje směrem ven směrem ke krytu a tlačí páku nahoru, čímž otevírá mezeru mezi pákou a blokem pro proudění tekutiny do další komory, což je definováno jako otevřený stav .Po uvolnění tlaku vzduchu se může páka vrátit do původní polohy a zůstat těsná díky pružnosti závěsu.Videa pohybů páky jsou uvedena v doplňkovém filmu S1.
A. Schematický diagram a fotografie v zavřeném stavu.Při nepřítomnosti tlaku páka tlačí membránu proti bloku a kapalina je utěsněna.b V dobrém stavu.Při působení tlaku se membrána roztáhne a tlačí páku nahoru, takže se kanál otevře a tekutina může proudit.c Určete charakteristickou velikost kritického tlaku.Mezi charakteristické rozměry patří délka páky (L), vzdálenost jezdce a závěsu (l) a tloušťka výstupku páky (t).Fs je zhutňovací síla v bodě B škrticí klapky. q je rovnoměrně rozložené zatížení páky.Tx* představuje krouticí moment vyvíjený sklopnou pákou.Kritický tlak je tlak potřebný ke zvednutí páky a zajištění průtoku tekutiny.d Teoretické a experimentální výsledky vztahu mezi kritickým tlakem a velikostí prvku.Bylo provedeno n = 6 nezávislých experimentů a data jsou uvedena jako ± standardní odchylka.Nezpracovaná data jsou prezentována jako soubory nezpracovaných dat.
Pro analýzu závislosti kritického tlaku Pc, při kterém se mezera otevírá, na geometrických parametrech (např. L je délka páky, l je vzdálenost mezi blokem a blokem) byl vyvinut analytický model založený na teorii nosníku. závěs, S je páka Kontaktní plocha s kapalinou t je tloušťka výstupku páky, jak je znázorněno na obr. 2c).Jak je podrobně uvedeno v doplňkových poznámkách a doplňkovém obrázku S3, mezera se otevře, když \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), kde Fs je točivý moment \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\), abyste odstranili síly spojené s uložením s přesahem a způsobily ohnutí závěsu.Experimentální odezva a analytický model vykazují dobrou shodu (obr. 2d), což ukazuje, že kritický tlak Pc roste s rostoucí t/l a snižující se L, což lze snadno vysvětlit klasickým modelem paprsku, tj. točivý moment roste s t/Lift .Naše teoretická analýza tedy jasně ukazuje, že kritický tlak lze efektivně ovládat úpravou délky páky L a poměru t/l, což poskytuje důležitý základ pro návrh platformy FAST-POCT.
Platforma FAST-POCT poskytuje multifunkční dávkování (zobrazeno na obrázku 3a s vložkou a experimentem), což je nejdůležitější vlastnost úspěšného POCT, kde tekutiny mohou proudit v libovolném směru a v jakémkoli pořadí (kaskádové, simultánní, sekvenční) nebo selektivní vícekanálové výdej .- funkce dávkování.Na Obr.3a(i) znázorňuje kaskádový režim dávkování, ve kterém jsou dvě nebo více komor kaskádovitě zapojeny pomocí bloků pro oddělení různých reaktantů a páky pro ovládání otevřeného a uzavřeného stavu.Když je aplikován tlak, kapalina proudí z horní do dolní komory kaskádovým způsobem.Je třeba poznamenat, že kaskádové komory mohou být naplněny mokrými chemikáliemi nebo suchými chemikáliemi, jako jsou lyofilizované prášky.V experimentu na obr. 3a(i) proudí červený inkoust z horní komory spolu s práškem modrého barviva (síran měďnatý) do druhé komory a po dosažení spodní komory se změní na tmavě modrou.Zobrazuje také řídicí tlak pro čerpanou kapalinu.Podobně, když je jedna páka připojena ke dvěma komorám, přejde do režimu současného vstřikování, jak je znázorněno na obr.3a(ii), ve kterém může být kapalina rovnoměrně rozdělena do dvou nebo více komor, když je aplikován tlak.Protože kritický tlak závisí na délce páky, lze délku páky upravit tak, aby se dosáhlo sekvenčního vstřikování, jak je znázorněno na obr.3a(iii).Dlouhá páka (s kritickým tlakem Pc_long) byla připojena ke komoře B a krátká páka (s kritickým tlakem Pc_short > Pc_long) byla připojena ke komoře A. Protože byl aplikován tlak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), byla pouze kapalina červeně může proudit do komory B, a když byl tlak zvýšen na P2 (> Pc_short), modrá kapalina může proudit do komory A. Tento režim sekvenčního vstřikování se vztahuje na různé kapaliny, které se postupně převádějí do příslušných komor, což je rozhodující pro úspěšný POCT přístroj.Dlouhá páka (s kritickým tlakem Pc_long) byla připojena ke komoře B a krátká páka (s kritickým tlakem Pc_short > Pc_long) byla připojena ke komoře A. Protože byl aplikován tlak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), byla pouze kapalina červeně může proudit do komory B, a když byl tlak zvýšen na P2 (> Pc_short), modrá kapalina může proudit do komory A. Tento režim sekvenčního vstřikování se vztahuje na různé kapaliny, které se postupně převádějí do příslušných komor, což je rozhodující pro úspěšný POCT přístroj.Длинный рычаг (с критическим давлением PC_LONG) ыы соединен с камерой b, а к к ыч ыч ыч ыч ыч ыч ыч ыч ыч ыч ыч ыч ыч ыч ыч ыч ыч ыч ыч оединен с камерой A. при приложении давления P1 (PC_LONG
a Ilustrace multifunkčního přiřazení, tj. (i) kaskádové, (ii) simultánní, (iii) sekvenční a (iv) selektivní přiřazení.Křivky představují pracovní postup a parametry těchto čtyř distribučních režimů.b Výsledky testů dlouhodobého skladování v deionizované vodě a etanolu.Bylo provedeno n = 5 nezávislých experimentů a data jsou uvedena jako ± sdc.Ukázky testu stability, když zařízení FAST a kapilární ventil (CV) byly ve (i) statickém a (ii) vibračním stavu.(iii) Objem vs. čas pro FAST a CV zařízení při různých úhlových frekvencích.d Zveřejnění výsledků testů na vyžádání pro (i) zařízení FAST a (ii) zařízení CV.(iii) Vztah mezi objemem a časem pro zařízení FAST a CV používající režim přerušovaného tlaku.Všechny stupnice, 1 cm.Nezpracovaná data se poskytují jako soubory nezpracovaných dat.
Dlouhodobé skladování reagencií je další důležitou vlastností úspěšného zařízení POCT, které umožní neškolenému personálu zacházet s více reagenciemi.Zatímco mnoho technologií prokázalo svůj potenciál pro dlouhodobé skladování (např. 35 mikrodispenzorů, 48 blistrových balení a 49 balíčků s tyčinkami), pro uložení balíčku je zapotřebí vyhrazená přijímací přihrádka, což zvyšuje náklady a složitost;dále tyto skladovací mechanismy neumožňují dávkování na požádání a vedou k plýtvání činidly v důsledku zbytků v obalu.Schopnost dlouhodobého skladování byla ověřena provedením zrychleného testu životnosti pomocí CNC obráběného materiálu PMMA kvůli jeho mírné drsnosti a odolnosti vůči prostupu plynu (doplňkový obrázek S5).Testovací přístroj byl naplněn deionizovanou vodou (deionizovaná voda) a 70% ethanolem (simulující těkavá činidla) při 65 °C po dobu 9 dnů.Jak deionizovaná voda, tak ethanol byly skladovány pomocí hliníkové fólie, aby se zablokoval přístup shora.K výpočtu ekvivalentu v reálném čase byla použita Arrheniova rovnice a penetrační aktivační energie uváděná v literatuře50,51.Na Obr.3b ukazuje průměrné výsledky úbytku hmotnosti pro 5 vzorků skladovaných při 65 °C po dobu 9 dnů, ekvivalentní 0,30 % pro deionizovanou vodu a 0,72 % pro 70 % ethanol během 2 let při 23 °C.
Na Obr.3c ukazuje vibrační test.Protože kapilární ventil (CV) je nejoblíbenější metodou manipulace s tekutinou mezi stávajícími zařízeními POCT28,29, bylo pro srovnání použito zařízení CV o šířce 300 µm a hloubce 200 µm.Je vidět, že když obě zařízení zůstanou nehybná, tekutina v platformě FAST-POCT se utěsní a tekutina v zařízení CV se zablokuje v důsledku náhlé expanze kanálu, což snižuje kapilární síly.Jak se však úhlová frekvence orbitálního vibrátoru zvyšuje, tekutina v platformě FAST-POCT zůstává utěsněná, ale tekutina v zařízení CV proudí do spodní komory (viz také doplňkový film S3).To naznačuje, že deformovatelné závěsy platformy FAST-POCT mohou vyvinout silnou mechanickou sílu na modul, aby těsně uzavřely kapalinu v komoře.V zařízeních CV se však kapalina zadržuje v důsledku rovnováhy mezi pevnou, vzduchovou a kapalnou fází, což vytváří nestabilitu a vibrace mohou narušit rovnováhu a způsobit neočekávané chování proudění.Výhodou platformy FAST-POCT je, že poskytuje spolehlivou funkčnost a zabraňuje poruchám v přítomnosti vibrací, které se obvykle vyskytují během dodávky a provozu.
Další důležitou vlastností platformy FAST-POCT je její vydání na vyžádání, což je klíčový požadavek pro kvantitativní analýzu.Na Obr.3d porovnává vydání platformy FAST-POCT na vyžádání a zařízení CV.Z Obr.3d(iii) vidíme, že zařízení FAST rychle reaguje na tlakový signál.Když byl na platformu FAST-POCT aplikován tlak, tekutina tekla, po uvolnění tlaku se tok okamžitě zastavil (obr. 3d(i)).Toto působení lze vysvětlit rychlým elastickým návratem závěsu, který přitlačí páku zpět k bloku a uzavře komoru.Tekutina však nadále proudila v zařízení CV, což nakonec mělo za následek neočekávaný objem tekutiny přibližně 100 µl po uvolnění tlaku (obrázek 3d(ii) a doplňkový film S4).To lze vysvětlit vymizením kapilárního pinning efektu po úplném zvlhčení CV po první injekci.
Schopnost manipulovat s kapalinami různé smáčivosti a viskozity ve stejném zařízení zůstává výzvou pro aplikace POCT.Špatná smáčivost může vést k netěsnostem nebo jinému neočekávanému chování proudění v kanálech a pro přípravu vysoce viskózních kapalin 52 jsou často vyžadována pomocná zařízení, jako jsou vířivé mixéry, odstředivky a filtry.Testovali jsme vztah mezi kritickým tlakem a vlastnostmi tekutiny (se širokým rozsahem smáčivosti a viskozity).Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 a videu S5.Je vidět, že v komoře mohou být utěsněny kapaliny různé smáčivosti a viskozity, a když je aplikován tlak, mohou být do sousední komory přeneseny i kapaliny s viskozitou až 5500 cP, což umožňuje detekovat vzorky s vysokou viskozita (tj. sputum, velmi viskózní vzorek používaný pro diagnostiku respiračních onemocnění).
Kombinací výše uvedených multifunkčních dávkovacích zařízení lze vyvinout širokou škálu POCT zařízení na bázi FAST.Příklad je znázorněn na obrázku 1. Zařízení obsahuje předskladovací komoru, směšovací komoru, reakční komoru a odpadní komoru.Reagencie mohou být uloženy v předskladovací komoře po delší dobu a poté vypuštěny do směšovací komory.Při správném tlaku mohou být smíšené reaktanty selektivně převedeny do odpadní komory nebo reakční komory.
Protože detekce PCR je zlatým standardem pro detekci patogenů, jako je H1N1 a COVID-19 a zahrnuje více reakčních kroků, použili jsme pro detekci PCR jako aplikaci platformu FAST-POCT.Na Obr.4 ukazuje proces testování PCR pomocí platformy FAST-POCT.Nejprve se eluční činidlo, činidlo pro magnetické mikrokuličky, promývací roztok A a promývací roztok W pipetovaly do předskladovacích komor E, M, W1 a W2, v daném pořadí.Stádia adsorpce RNA jsou znázorněna na Obr.4a a jsou následující: (1) když je aplikován tlak P1 (= 0,26 bar), vzorek se pohybuje do komory M a je vypouštěn do směšovací komory.(2) Tlak vzduchu P2 (= 0,12 bar) je přiváděn přes port A připojený ke spodní části směšovací komory.Ačkoli řada metod míchání prokázala svůj potenciál při míchání kapalin na platformách POCT (např. hadovité míchání 53, náhodné míchání 54 a vsádkové míchání 55), jejich účinnost a účinnost míchání stále nejsou uspokojivé.Přijímá metodu míchání bublin, při které se vzduch zavádí do spodní části směšovací komory, aby se v kapalině vytvořily bubliny, po kterých může výkonný vír dosáhnout úplného promíchání během několika sekund.Byly provedeny experimenty s mícháním bublin a výsledky jsou uvedeny na doplňkovém obrázku S6.Je vidět, že při použití tlaku 0,10 bar trvá úplné promíchání asi 8 sekund.Zvýšením tlaku na 0,20 bar je dosaženo úplného promíchání za cca 2 sekundy.Metody pro výpočet účinnosti míchání jsou uvedeny v části Metody.(3) Použijte rubidiový magnet k extrahování kuliček, poté natlakujte P3 (= 0,17 bar) přes port P, aby se reagencie přemístily do odpadní komory.Na Obr.4b,c znázorňuje promývací kroky k odstranění nečistot ze vzorku následovně: (1) Promývací roztok A z komory W1 je vypouštěn do tlakové směšovací komory P1.(2) Poté proveďte proces míchání bublin.(3) Promývací roztok A se přenese do komory pro odpadní kapalinu a mikrokuličky v směšovací komoře jsou vytaženy magnetem.Promývání W (obr. 4c) bylo podobné promývání A (obr. 4b).Je třeba poznamenat, že každý promývací krok A a W byl proveden dvakrát.Obrázek 4d ukazuje eluční kroky pro eluci RNA z kuliček;kroky zavádění eluce a míchání jsou stejné jako kroky adsorpce RNA a promývací kroky popsané výše.Když jsou eluční činidla přenesena do PCR reakční komory pod tlaky P3 a P4 (=0,23 bar), je dosaženo kritického tlaku pro utěsnění ramene reakční komory PCR.Podobně tlak P4 také pomáhá utěsnit průchod do odpadní komory.Všechna eluční činidla byla tedy rovnoměrně rozdělena mezi čtyři reakční komory PCR, aby se iniciovaly multiplexní reakce PCR.Výše uvedený postup je uveden v doplňkovém filmu S6.
V kroku adsorpce RNA je vzorek zaveden do vstupu M a vstřikován do směšovací komory spolu s dříve uloženým roztokem kuliček.Po promíchání a odstranění granulí jsou činidla distribuována do odpadní komory.b a c promývacích krocích, zaveďte různá předem uložená promývací činidla do mísící komory a po smíchání a odstranění kuliček přeneste činidla do komory na odpadní kapalinu.d Krok eluce: Po zavedení elučních činidel, smíchání a extrakci kuliček se činidla přenesou do reakční komory PCR.Křivky ukazují pracovní postup a související parametry různých fází.Tlak je tlak vyvíjený jednotlivými komorami.Objem je objem kapaliny v směšovací komoře.Všechny stupnice jsou 1 cm.Nezpracovaná data se poskytují jako soubory nezpracovaných dat.
Byl proveden postup testování PCR a doplňkový obrázek S7 představuje tepelné profily včetně 20 minut doby reverzní transkripce a 60 minut doby tepelného cyklování (95 a 60 °C), přičemž jeden tepelný cyklus je 90 s (doplňkový film S7)..FAST-POCT vyžaduje méně času na dokončení jednoho tepelného cyklu (90 sekund) než konvenční RT-PCR (180 sekund na jeden tepelný cyklus).To lze vysvětlit vysokým poměrem plochy povrchu k objemu a nízkou tepelnou setrvačností reakční komory mikro-PCR.Povrch komory je 96,6 mm2 a objem komory je 25 mm3, takže poměr povrchu k objemu je přibližně 3,86.Jak je vidět na doplňkovém obrázku S10, testovací oblast PCR naší platformy má drážku na zadním panelu, díky čemuž je dno komory PCR 200 µm silné.K topné ploše regulátoru teploty je připevněna tepelně vodivá elastická podložka, která zajišťuje těsný kontakt se zadní částí testovací krabice.To snižuje tepelnou setrvačnost platformy a zlepšuje účinnost vytápění/chlazení.Během tepelného cyklování se parafín zapuštěný do platformy taví a proudí do reakční komory PCR, kde působí jako těsnicí prostředek, aby se zabránilo odpařování činidla a kontaminaci životního prostředí (viz doplňkový film S8).
Všechny procesy detekce PCR popsané výše byly plně automatizovány pomocí na zakázku vyrobeného přístroje FAST-POCT, který se skládal z naprogramované jednotky pro řízení tlaku, jednotky magnetické extrakce, jednotky pro řízení teploty a jednotky pro zachycení a zpracování fluorescenčního signálu.Je třeba poznamenat, že jsme použili platformu FAST-POCT pro izolaci RNA a poté jsme použili extrahované vzorky RNA pro reakce PCR pomocí systému FAST-POCT a stolního systému PCR pro srovnání.Výsledky byly téměř stejné jako na doplňkovém obrázku S8.Operátor provede jednoduchý úkol: vloží vzorek do M-komory a vloží platformu do přístroje.Výsledky kvantitativního testu jsou k dispozici přibližně za 82 minut.Podrobné informace o nástrojích FAST-POCT naleznete na doplňkovém obrázku.C9, C10 a C11.
Chřipka způsobená viry chřipky A (IAV), B (IBV), C (ICV) a D (IDV) je běžný celosvětový jev.Z nich jsou IAV a IBV zodpovědné za nejzávažnější případy a sezónní epidemie, infikují 5-15 % světové populace, způsobují 3-5 milionů vážných případů a způsobují 290 000-650 000 úmrtí ročně.Nemoci dýchacích cest56,57.Včasná diagnostika IAV a IB je nezbytná pro snížení morbidity a související ekonomické zátěže.Mezi dostupnými diagnostickými technikami je reverzní transkriptázová polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) považována za nejcitlivější, nejspecifičtější a nejpřesnější (>99 %)58,59.Mezi dostupnými diagnostickými technikami je reverzní transkriptázová polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) považována za nejcitlivější, nejspecifičtější a nejpřesnější (>99 %)58,59.Среди доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с оОратния с обратнов ЦР) считается наиболее чувствительной, специфичной и точной (> 99%)58,59.Mezi dostupnými diagnostickými metodami je za nejcitlivější, nejspecifičtější a nejpřesnější (> 99 %) považována reverzní transkriptázová polymerázová řetězová reakce (RT-PCR)58,59. Из доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с оОтиПной оОтратной Р) считается наиболее чувствительной, специфичной и точной (>99%)58,59.Z dostupných diagnostických metod je za nejcitlivější, nejspecifičtější a nejpřesnější (>99 %) považována reverzní transkriptázová polymerázová řetězová reakce (RT-PCR)58,59.Tradiční metody RT-PCR však vyžadují opakované pipetování, míchání, dávkování a přenos tekutiny, což omezuje jejich použití profesionály v prostředí s omezenými zdroji.Zde byla pro PCR detekci IAV a IBV použita platforma FAST-POCT, aby se získal jejich dolní limit detekce (LOD).Kromě toho byly IAV a IBV multiplexovány, aby rozlišovaly mezi různými patotypy napříč druhy, což poskytuje slibnou platformu pro genetickou analýzu a schopnost přesně léčit onemocnění.
Na Obr.5a ukazuje výsledky HAV PCR testování s použitím 150 ul purifikované virové RNA jako vzorku.Na Obr.5a(i) ukazuje, že při koncentraci HAV 106 kopií/ml může intenzita fluorescence (ARn) dosáhnout 0,830, a když se koncentrace sníží na 102 kopií/ml, může ΔRn stále dosáhnout 0,365, což odpovídá vyššímu prázdné negativní kontrolní skupiny ( 0,002), asi 100krát vyšší.Pro kvantifikaci na základě šesti nezávislých experimentů byla vytvořena lineární kalibrační křivka mezi logaritmickou koncentrací a prahovou hodnotou cyklu (Ct) IAV (obr. 5a(ii)), R2 = 0,993, v rozmezí 102-106 kopií/ml.výsledky jsou v dobré shodě s konvenčními metodami RT-PCR.Na Obr.5a(iii) ukazuje fluorescenční obrazy výsledků testu po 40 cyklech platformy FAST-POCT.Zjistili jsme, že platforma FAST-POCT dokáže detekovat HAV již od 102 kopií/ml.Tradiční metoda však nemá hodnotu Ct 102 kopií/ml, což z ní činí LOD asi 103 kopií/ml.Předpokládali jsme, že to může být způsobeno vysokou účinností míchání bublin.Testy PCR byly provedeny na purifikované IAV RNA za účelem vyhodnocení různých metod míchání, včetně míchání protřepáváním (stejná metoda míchání jako při konvenčním provozu RT-PCR), míchání v lahvičkách (tato metoda, 3 s při 0,12 baru) a bez míchání jako kontrolní skupina ..Výsledky lze nalézt na doplňkovém obrázku S12.Je vidět, že při vyšší koncentraci RNA (106 kopií/ml) jsou hodnoty Ct různých metod míchání téměř stejné jako u bublinkového míchání.Když koncentrace RNA klesla na 102 kopií/ml, směs protřepávání a kontroly neměly žádné hodnoty Ct, zatímco metoda bublinkové směsi stále poskytovala hodnotu Ct 36,9, což bylo pod prahem Ct 38. Výsledky ukazují dominantní charakteristiku míchání vezikuly, což bylo prokázáno i v jiné literatuře, což může také vysvětlit, proč je senzitivita platformy FAST-POCT o něco vyšší než u konvenční RT-PCR.Na Obr.5b ukazuje výsledky PCR analýzy purifikovaných vzorků IBV RNA v rozsahu od 101 do 106 kopií/ml.Výsledky byly podobné jako u testu IAV, dosáhly R2 = 0,994 a LOD 102 kopií/ml.
PCR analýza viru chřipky A (IAV) s koncentracemi IAV v rozmezí 106 až 101 kopií/ml s použitím TE pufru jako negativní kontroly (NC).(i) Fluorescenční křivka v reálném čase.(ii) Lineární kalibrační křivka mezi logaritmickou koncentrací IAV RNA a prahem cyklu (Ct) pro FAST a konvenční testovací metody.(iii) IAV FAST-POCT fluorescenční snímek po 40 cyklech.b, PCR detekce viru chřipky B (IBV) s (i) fluorescenčním spektrem v reálném čase.(ii) Lineární kalibrační křivka a (iii) FAST-POCT IBV fluorescenční snímek po 40 cyklech.Dolní mez detekce (LOD) pro IAV a IBV pomocí platformy FAST-POCT byla 102 kopií/ml, což je méně než u konvenčních metod (103 kopií/ml).c Výsledky multiplexních testů pro IAV a IBV.GAPDH byl použit jako pozitivní kontrola a TE pufr byl použit jako negativní kontrola, aby se zabránilo možné kontaminaci a amplifikaci pozadí.Lze rozlišit čtyři různé typy vzorků: (1) negativní vzorky pouze GAPDH („IAV-/IBV-“);(2) infekce IAV („IAV+/IBV-“) s IAV a GAPDH;(3) infekce IBV („IAV-/IBV+“) s IBV a GAPDH;(4) Infekce IAV/IBV („IAV+/IBV+“) s IAV, IBV a GAPDH.Tečkovaná čára představuje prahovou čáru.Bylo provedeno n = 6 biologicky nezávislých experimentů, data jsou uvedena jako ± standardní odchylka.Nezpracovaná data jsou prezentována jako soubory nezpracovaných dat.
Na Obr.5c ukazuje výsledky testu multiplexování pro IAV/IBV.Zde byl virový lyzát použit jako roztok vzorku místo purifikované RNA a čtyři primery pro IAV, IBV, GAPDH (pozitivní kontrola) a TE pufr (negativní kontrola) byly přidány do čtyř různých reakčních komor platformy FAST-POCT.Zde se používají pozitivní a negativní kontroly, aby se zabránilo možné kontaminaci a zvýšení pozadí.Testy byly rozděleny do čtyř skupin: (1) GAPDH-negativní vzorky („IAV-/IBV-“);(2) IAV-infikované („IAV+/IBV-“) versus IAV a GAPDH;(3) IBV-.infikovaný ("IAV-") -/IBV+") IBV a GAPDH;(4) IAV/IBV („IAV+/IBV+“) infekce IAV, IBV a GAPDH.Na Obr.5c ukazuje, že když byly aplikovány negativní vzorky, intenzita fluorescence ARn pozitivní kontrolní komory byla 0,860 a ARn IAV a IBV byla podobná negativní kontrole (0,002).Pro skupiny IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ a IAV+/IBV+ vykazovaly kamery IAV/GAPDH, IBV/GAPDH a IAV/IBV/GAPDH významnou intenzitu fluorescence, zatímco ostatní kamery dokonce vykazovaly intenzitu fluorescence na pozadí. úroveň 40 po tepelném cyklování.Z výše uvedených testů vykázala platforma FAST-POCT vynikající specificitu a umožnila nám současně patotypizovat různé viry chřipky.
Abychom potvrdili klinickou použitelnost FAST-POCT, testovali jsme 36 klinických vzorků (vzorky výtěrů z nosu) od pacientů s IB (n=18) a kontrol bez IB (n=18) (obrázek 6a).Informace o pacientech jsou uvedeny v doplňkové tabulce 3. Stav infekce IB byl nezávisle potvrzen a protokol studie byl schválen první přidruženou nemocnicí Zhejiang University (Hangzhou, Zhejiang).Každý vzorek pacientů byl rozdělen do dvou kategorií.Jeden byl zpracován pomocí FAST-POCT a druhý byl zpracován pomocí stolního systému PCR (SLAN-96P, Čína).Oba testy používají stejné purifikační a detekční soupravy.Na Obr.6b ukazuje výsledky FAST-POCT a konvenční reverzní transkripční PCR (RT-PCR).Porovnali jsme intenzitu fluorescence (FAST-POCT) s -log2(Ct), kde Ct je práh cyklu pro konvenční RT-PCR.Mezi oběma metodami byla dobrá shoda.FAST-POCT a RT-PCR ukázaly silnou pozitivní korelaci s hodnotou Pearsonova poměru (r) 0,90 (obrázek 6b).Poté jsme hodnotili diagnostickou přesnost FAST-POCT.Distribuce intenzity fluorescence (FL) pro pozitivní a negativní vzorky byly poskytnuty jako nezávislé analytické měření (obr. 6c).Hodnoty FL byly významně vyšší u pacientů s IB než u kontrol (****P = 3,31 × 10-19; dvoustranný t-test) (obr. 6d).Dále byly vyneseny křivky provozních charakteristik přijímače IBV (ROC).Zjistili jsme, že diagnostická přesnost byla velmi dobrá, s plochou pod křivkou 1 (obr. 6e).Vezměte prosím na vědomí, že kvůli povinnému objednávání roušek v Číně kvůli COVID-19 od roku 2020 jsme neidentifikovali pacienty s IBD, takže všechny pozitivní klinické vzorky (tj. vzorky z nosních výtěrů) byly pouze pro IBV.
Design klinické studie.Pomocí platformy FAST-POCT a konvenční RT-PCR bylo analyzováno celkem 36 vzorků, včetně 18 vzorků pacientů a 18 nechřipkových kontrol.b Zhodnoťte analytickou konzistenci mezi FAST-POCT PCR a konvenční RT-PCR.Výsledky pozitivně korelovaly (Pearson r = 0,90).c Hladiny intenzity fluorescence u 18 pacientů s IB a 18 kontrol.d U pacientů s IB (+) byly hodnoty FL významně vyšší než v kontrolní skupině (-) (****P = 3,31 × 10-19; dvoustranný t-test; n = 36).Pro každý čtvercový graf představuje černá značka uprostřed medián a spodní a horní čára rámečku představuje 25. a 75. percentil.Whiskery se rozšiřují na minimální a maximální datové body, které nejsou považovány za odlehlé hodnoty.e ROC křivka.Tečkovaná čára d představuje prahovou hodnotu odhadnutou z ROC analýzy.AUC pro IBV je 1. Nezpracovaná data se poskytují jako soubory nezpracovaných dat.
V tomto článku představujeme FAST, který má vlastnosti potřebné pro ideální POCT.Mezi výhody naší technologie patří: (1) Všestranné dávkování (kaskádové, simultánní, sekvenční a selektivní), uvolňování na vyžádání (rychlé a proporcionální uvolňování aplikovaného tlaku) a spolehlivý provoz (vibrace při 150 stupních) (2) dlouhodobé skladování (2 roky zrychleného testování, úbytek hmotnosti asi 0,3 %);(3) schopnost pracovat s kapalinami se širokým rozsahem smáčivosti a viskozity (viskozita až 5500 cP);(4) Ekonomické (odhadované náklady na materiál zařízení FAST-POCT PCR jsou přibližně 1 USD).Kombinací multifunkčních dávkovačů byla demonstrována a aplikována integrovaná platforma FAST-POCT pro PCR detekci virů chřipky A a B.FAST-POCT trvá pouze 82 minut.Klinické testy s 36 vzorky nosních výtěrů prokázaly dobrou shodu intenzity fluorescence se standardní RT-PCR (Pearsonovy koeficienty > 0,9).Klinické testy s 36 vzorky nosních výtěrů prokázaly dobrou shodu intenzity fluorescence se standardní RT-PCR (Pearsonovy koeficienty > 0,9).Клинические тесты с 36 образцами мазков из носа показали хорошее соответствисиовентентвие инентент тандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Klinické testy s 36 vzorky nosních výtěrů prokázaly dobrou shodu s intenzitou fluorescence standardní RT-PCR (Pearsonovy koeficienty > 0,9). RT-PCR Клинические испытания 36 образцов мазков из носа показали хорошее совпадениесиовоне инене со стандартной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Klinické testování 36 vzorků z nosních výtěrů ukázalo dobrou shodu intenzity fluorescence se standardní RT-PCR (Pearsonův koeficient > 0,9).Paralelně s touto prací prokázaly svůj potenciál v POCT různé nově vznikající biochemické metody (např. tepelné cyklování plazmy, imunotesty bez amplifikace a testy funkcionalizace nanobody).Vzhledem k nedostatku plně integrované a robustní platformy POCT však tyto metody nevyhnutelně vyžadují samostatné postupy předběžného zpracování (např. izolace RNA44, inkubace45 a promývání46), což dále doplňuje současnou práci s těmito metodami za účelem implementace pokročilých funkcí POCT s požadované parametry.fetch-in-response-output performance.V této práci, ačkoliv je vzduchové čerpadlo použité k aktivaci ventilu FAST dostatečně malé, aby se dalo integrovat do stolního přístroje (obr. S9, S10), stále spotřebovává značnou energii a generuje hluk.V zásadě mohou být pneumatická čerpadla menšího tvaru nahrazena jinými prostředky, jako je použití elektromagnetické síly nebo ovládání prsty.Mezi další vylepšení může patřit například přizpůsobení souprav pro různé a specifické biochemické testy s využitím nových detekčních metod, které nevyžadují systémy zahřívání/chlazení, čímž se poskytuje platforma POCT bez použití nástrojů pro aplikace PCR.Věříme, že vzhledem k tomu, že platforma FAST poskytuje způsob, jak manipulovat s kapalinami, věříme, že navrhovaná technologie FAST představuje potenciál pro vytvoření společné platformy nejen pro biomedicínské testování, ale také pro monitorování životního prostředí, testování kvality potravin, syntézu materiálů a léků. ..
Odběr a použití vzorků lidských nosních výtěrů schválila Etická komise první přidružené nemocnice univerzity Zhejiang (IIT20220330B).Bylo odebráno 36 vzorků nosních výtěrů, zahrnujících 16 dospělých < 30 let, 7 dospělých > 40 let a 19 mužů, 17 žen.Bylo odebráno 36 vzorků nosních výtěrů, zahrnujících 16 dospělých < 30 let, 7 dospělých > 40 let a 19 mužů, 17 žen.Было собрано 36 образцов мазков из носа, в которых приняли участие 16 взрослытх, 30, 7 0 лет, 19 мужчин a 17 женщин.Bylo odebráno 36 vzorků nosních výtěrů od 16 dospělých ve věku < 30 let, 7 dospělých ve věku nad 40 let, 19 mužů a 17 žen.Demografické údaje jsou uvedeny v doplňkové tabulce 3. Od všech účastníků byl získán informovaný souhlas.Všichni účastníci byli podezřelí z chřipky a byli dobrovolně testováni bez náhrady.
Základna a víko FAST jsou vyrobeny z kyseliny polymléčné (PLA) a vytištěny 3D tiskárnou Ender 3 Pro (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).Oboustranná páska byla zakoupena od Adhesives Research, Inc. Model 90880. PET film o tloušťce 100 um byl zakoupen od McMaster-Carr.Jak lepidlo, tak PET fólie byly řezány pomocí řezačky Silhouette Cameo 2 od Silhouette America, Inc. Elastická fólie je vyrobena z materiálu PDMS vstřikováním.Nejprve byl pomocí laserového systému vyříznut rámeček z PET o tloušťce 200 µm a přilepen na 3 mm silnou PMMA fólii pomocí 100 µm oboustranné lepicí pásky.Prekurzor PDMS (Sylgard 184; část A: část B = 10:1, Dow Corning) byl poté nalit do formy a k odstranění přebytku PDMS byla použita skleněná tyčinka.Po vytvrzení při 70 °C po dobu 3 hodin bylo možné z formy sloupnout 300 μm silný film PDMS.
Fotografie pro všestrannou distribuci, publikování na vyžádání a spolehlivý výkon jsou pořizovány vysokorychlostním fotoaparátem (Sony AX700 1000 fps).Orbitální třepačka použitá v testu spolehlivosti byla zakoupena od SCILOGEX (SCI-O180).Tlak vzduchu je generován vzduchovým kompresorem a k nastavení hodnoty tlaku se používá několik přesných digitálních regulátorů tlaku.Proces testování chování toku je následující.Předem stanovené množství tekutiny bylo vstříknuto do testovacího zařízení a byla použita vysokorychlostní kamera pro záznam chování proudění.Statické snímky byly poté pořízeny z videí chování proudění v pevně stanovených časech a zbývající plocha byla vypočtena pomocí softwaru Image-Pro Plus, který byl poté vynásoben hloubkou kamery pro výpočet objemu.Podrobnosti o systému testování chování toku lze nalézt na doplňkovém obrázku S4.
Do mísícího zařízení lahviček vstříkněte 50 µl mikrokuliček a 100 µl deionizované vody.Snímky smíšeného výkonu byly pořizovány vysokorychlostní kamerou každých 0,1 sekundy při tlacích 0,1 bar, 0,15 bar a 0,2 bar.Informace o pixelech během procesu prolnutí lze z těchto snímků získat pomocí softwaru pro zpracování fotografií (Photoshop CS6).A účinnosti míchání lze dosáhnout pomocí následující rovnice 53.
kde M je účinnost míchání, N je celkový počet pixelů vzorku a ci a \(\bar{c}\) jsou normalizované a očekávané normalizované koncentrace.Účinnost míchání se pohybuje od 0 (0 %, nemíchané) do 1 (100 %, plně promíchané).Výsledky jsou uvedeny na doplňkovém obrázku S6.
Souprava RT-PCR v reálném čase pro IAV a IBV, včetně vzorků IAV a IBV RNA (kat. č. RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, Čína), Tris-EDTA pufr (TE pufr č. B541019 , Sangon Biotech, Čína), Positive Control RNA Purification Kit (Č. dílu Z-ME-0010, Liferiver, Čína) a roztok GAPDH (Č. dílu M591101, Sangon Biotech, Čína) jsou komerčně dostupné.Sada pro čištění RNA obsahuje vazebný pufr, promývací roztok A, promývací roztok W, eluent, magnetické mikrokuličky a akrylový nosič.Soupravy IAV a IBV pro RT-PCR v reálném čase zahrnují detekční směs nukleové kyseliny IFVA a enzym RT-PCR.Přidejte 6 µl AcrylCarrier a 20 µl magnetických kuliček k 500 µl roztoku vazebného pufru, dobře protřepejte a poté připravte roztok kuliček.Přidejte 21 ml ethanolu k promývacím kapalinám A a W, dobře protřepejte, abyste získali roztoky promývacích kapalin A a W.Potom bylo 18 ul fluorescenční PCR směsi s IFVA nukleovou kyselinou a 1 ul RT-PCR enzymu přidáno k 1 ul TE roztoku, třepáno a centrifugováno několik sekund, čímž bylo získáno 20 ul IAV a IBV primerů.
Postupujte podle následujícího postupu čištění RNA: (1) Adsorpce RNA.Napipetujte 526 µl peletového roztoku do 1,5 ml centrifugační zkumavky a přidejte 150 µl vzorku, poté zkumavku 10krát ručně protřepejte nahoru a dolů.Přeneste 676 µl směsi do afinitní kolony a centrifugujte při 1,88 x 104 g po dobu 60 sekund.Následné drenáže jsou pak vyřazeny.(2) První fáze praní.Přidejte 500 µl promývacího roztoku A do afinitní kolony, odstřeďujte při 1,88 x 104 g po dobu 40 s a použitý roztok zlikvidujte.Tento promývací proces byl dvakrát opakován.(3) druhá fáze praní.Přidejte 500 µl promývacího roztoku W do afinitní kolony, odstřeďujte při 1,88×104 g po dobu 15 s a vyčerpaný roztok zlikvidujte.Tento promývací proces byl dvakrát opakován.(4) Eluce.Přidejte 200 µl eluátu do afinitní kolony a centrifugujte při 1,88 x 104 g po dobu 2 minut.(5) RT-PCR: Eluát byl vstříknut do 20 μl roztoku primeru ve zkumavce PCR, poté byla zkumavka umístěna do testovacího zařízení pro PCR v reálném čase (SLAN-96P), aby se provedl proces RT-PCR.Celý proces detekce trvá přibližně 140 minut (20 minut pro purifikaci RNA a 120 minut pro detekci PCR).
Předběžně bylo přidáno 526 ul roztoku kuliček, 1000 ul promývacího roztoku A, 1000 ul promývacího roztoku W, 200 ul eluátu a 20 ul roztoku primeru a uloženo v komůrkách M, W1, W2, E a PCR detekční komůrce.Montáž plošiny.Poté bylo 150 ul vzorku napipetováno do komory M a platforma FAST-POCT byla vložena do testovacího přístroje zobrazeného na doplňkovém obrázku S9.Po asi 82 minutách byly k dispozici výsledky testu.
Pokud není uvedeno jinak, jsou všechny výsledky testů prezentovány jako průměr ± SD po minimálně šesti replikátech pouze za použití platformy FAST-POCT a biologicky nezávislých vzorků.Z analýzy nebyla vyloučena žádná data.Experimenty nejsou náhodné.Výzkumníci nebyli během experimentu slepí vůči skupinovým úkolům.
Další informace o designu studie najdete v abstraktu Nature Research Report propojeném s tímto článkem.
Údaje podporující výsledky této studie jsou k dispozici v doplňkových informacích.Tento článek poskytuje původní data.
Chagla, Z. & Madhukar, P. Přeočkování COVID-19 v bohatých zemích zdrží očkování pro všechny.Chagla, Z. & Madhukar, P. Přeočkování COVID-19 v bohatých zemích zdrží očkování pro všechny.Chagla, Z. a Madhukar, P. Přeočkování COVID-19 v bohatých zemích oddálí očkování pro každého.Chagla, Z. a Madhukar, P. Přeočkování COVID-19 v bohatých zemích oddálí očkování pro všechny.Národní medicína.27, 1659–1665 (2021).
Faust, L. a kol.Testování SARS-CoV-2 v zemích s nízkými a středními příjmy: dostupnost a cenová dostupnost v soukromém sektoru zdravotní péče.mikrobiální infekce.22, 511–514 (2020).
Světová zdravotnická organizace.Globální prevalence a incidence vybraných léčitelných sexuálně přenosných infekcí: přehled a odhady.Ženeva: WHO, WHO/HIV_AIDS/2 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66818/WHO_HIV_AIDS_2001.02.pdf (2001).
Fenton, EM a kol.Vícenásobné 2D tvarované boční průtokové testovací proužky.Aplikace ASS.alma mater.Inter Milán.1, 124–129 (2009).
Schilling, KM a kol.Plně uzavřené mikrofluidní analytické zařízení na bázi papíru.řitní otvor.Chemikálie.84, 1579–1585 (2012).
Lapenter, N. a kol.Kompetitivní papírová imunochromatografie spojená s enzymaticky modifikovanými elektrodami umožňuje bezdrátové monitorování a elektrochemické stanovení kotininu v moči.Senzory 21, 1659 (2021).
Zhu, X. a kol.Kvantifikace biomarkerů onemocnění pomocí univerzální platformy pro laterální tekutinu integrovanou nanozymy pomocí glukometru.biologický senzor.Bioelektronika.126, 690–696 (2019).
Boo, S. a kol.Těhotenský testovací proužek pro detekci patogenních bakterií pomocí hybridních nanokvětin concanavalin A-lidský choriový gonadotropin-Cu3(PO4)2, magnetické separace a čtení chytrým telefonem.Mikropočítač.Časopis.185, 464 (2018).